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近日，中國藥科大學(xué)董廖斌課題組聯(lián)合南京大學(xué)張博副教授和美國佛羅里達(dá)大學(xué)Jeffrey Rudolf助理教授，獲得并解析了首個(gè)細(xì)菌來源II型倍半萜環(huán)化酶的晶體結(jié)構(gòu)，破解了存在于II型萜類環(huán)化酶家族中數(shù)十年的催化機(jī)制難題——鎂離子結(jié)合簇，進(jìn)而完整解析出該家族環(huán)化酶的詳細(xì)催化機(jī)制，相關(guān)研究成果以“Discovery, Structure, and Mechanism of a Class II Sesquiterpene Cyclase”為題發(fā)表在Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c09412）上。

萜類天然產(chǎn)物是自然界中數(shù)量最多，結(jié)構(gòu)最多樣化的天然產(chǎn)物家族。萜類天然產(chǎn)物來源于不同長度的線性焦磷酸前體，而萜類環(huán)化酶負(fù)責(zé)催化該線性前體生成多環(huán)結(jié)構(gòu)。根據(jù)不同的催化機(jī)制，序列及晶體結(jié)構(gòu)，萜類環(huán)化酶可被分為兩類，即I型和II型萜類環(huán)化酶。I型萜類環(huán)化酶通過脫去焦磷酸基團(tuán)形成碳正離子進(jìn)而環(huán)化，該過程依賴鎂離子的參與。目前，已有報(bào)道超過30種 I型萜類環(huán)化酶的晶體結(jié)構(gòu)，其中的鎂離子結(jié)合簇也得到了深入的研究，其主要位于焦磷酸基團(tuán)周邊且與萜類環(huán)化酶的DDxxD及NSE/DTE催化基序有極性相關(guān)。但I(xiàn)I型萜類環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)目前僅報(bào)道7例，其中5例的底物均具有焦磷酸基團(tuán)；根據(jù)相關(guān)的生物化學(xué)體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，II型萜類環(huán)化酶通過質(zhì)子化底物的末端雙鍵或者環(huán)氧基團(tuán)形成碳正離子，不需脫去焦磷酸基團(tuán)，但加入金屬鎂離子后，其催化效率呈現(xiàn)數(shù)千倍的增長，故有假設(shè)認(rèn)為II型萜類環(huán)化酶中也存在一個(gè)鎂離子結(jié)合簇，以輔助底物結(jié)合于酶的活性空腔。但在此前報(bào)道的5個(gè)II型萜類環(huán)化酶結(jié)構(gòu)中均未發(fā)現(xiàn)這一鎂離子結(jié)合簇。此外，在已有的7個(gè)II型萜類環(huán)化酶中，2個(gè)為三萜環(huán)化酶，4個(gè)為二萜環(huán)化酶，1個(gè)為雜萜環(huán)化酶，唯獨(dú)倍半萜環(huán)化酶的結(jié)構(gòu)尚未報(bào)道。針對(duì)以上科學(xué)問題，董廖斌課題組開展了找尋II型倍半萜環(huán)化酶的研究工作。

首先，作者對(duì)角鯊烯-霍烷環(huán)化酶的PFAM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩查。根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，剔除已知的二萜環(huán)化酶及三萜環(huán)化酶及其相似基因的序列，得到45個(gè)潛在的II型倍半萜萜類環(huán)化酶基因。隨后，針對(duì)該45個(gè)環(huán)化酶的基因序列分析顯示，其中的12個(gè)基因具有 DxDD的保守催化基序；進(jìn)一步結(jié)合基因組信息，發(fā)現(xiàn)其中的兩個(gè)酶A0A2P2GK84 (Streptomyces showdoensis)及F8JSS1 (Streptomyces cattleya)的上游緊鄰著一個(gè)Nudix水解酶，這一類型的水解酶曾報(bào)道于部分萜類的生物合成途徑中，發(fā)揮著單磷酸水解酶的作用。該基因組信息提示A0A2P2GK84及F8JSS1可能是潛在的單功能II型倍半萜環(huán)化酶。隨后通過體內(nèi)異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)，作者成功獲得該酶的催化產(chǎn)物并將其鑒定為倍半萜drimenol，進(jìn)一步體外生化表征實(shí)驗(yàn)揭示其為II型萜類環(huán)化酶，并分別命名為SsDMS和ScDMS。

為了對(duì)該特殊的II型倍半萜環(huán)化酶進(jìn)行深入的研究，作者通過篩選和優(yōu)化結(jié)晶條件獲得了SsDMS的高質(zhì)量apo-SsDMS（1.58 ?）及其復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。通過比較apo-SsDMS與經(jīng)典的植物及細(xì)菌ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）合酶發(fā)現(xiàn)，SsDMS是一個(gè)經(jīng)典的以β結(jié)構(gòu)域主導(dǎo)的βγ雙結(jié)構(gòu)域環(huán)化酶，其催化酸基團(tuán)D303及R403的位置相較于二萜和三萜環(huán)化酶更為偏上，擁有著更小的活性口袋，暗示SsDMS為天然的II型倍半萜環(huán)化酶。此外，針對(duì)催化酸基團(tuán)的突變結(jié)果顯示該區(qū)域?yàn)榇呋^程中的關(guān)鍵位點(diǎn)。

通過比對(duì)SsDMS的復(fù)合物與apo-SsDMS結(jié)構(gòu)，作者發(fā)現(xiàn)活性口袋中的多個(gè)氨基酸殘基在底物進(jìn)入口袋后發(fā)生了位移，且在活性口袋中的焦磷酸基團(tuán)附近發(fā)現(xiàn)了一個(gè)含有兩個(gè)鎂離子的金屬離子簇W165在apo狀態(tài)下，其側(cè)鏈位于底物的焦磷酸部分，而底物進(jìn)入后，W165連帶相鄰的L166向外擴(kuò)張使得香葉基焦磷酸（FPP）得以進(jìn)入活性空腔，且原先位于活性口袋外的R132在底物進(jìn)入后調(diào)轉(zhuǎn)側(cè)鏈?zhǔn)蛊渑c焦磷酸基團(tuán)作用，而與鎂離子互作的外周谷氨酸E169的側(cè)鏈在底物進(jìn)入后發(fā)生一定的翻轉(zhuǎn)，使其與鎂離子結(jié)合，從而起到錨定焦磷酸基團(tuán)的作用。結(jié)合周邊與焦磷酸互作的氨基酸信息，作者針對(duì)這些氨基酸進(jìn)行了定點(diǎn)突變，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些氨基酸對(duì)于催化的重要性。更為重要的是，將E169突變?yōu)锳或D后，SsDMS均失去了原有的活性，這表明與金屬離子互作的氨基酸側(cè)鏈長度起著關(guān)鍵作用。

基于以上研究結(jié)果，作者推測出該II型倍半萜合酶的完整催化機(jī)制，即在起始階段，底物FPP形成一個(gè)預(yù)折疊的狀態(tài)。底物FPP進(jìn)入口袋時(shí)，W165與L166離開活性空腔；FPP進(jìn)入后，R132翻轉(zhuǎn)與焦磷酸基團(tuán)互作；D303質(zhì)子化末端雙鍵產(chǎn)生碳正離子啟動(dòng)環(huán)化過程；此時(shí)，口袋周邊的多個(gè)芳香性殘基穩(wěn)定產(chǎn)生的碳正離子中間體。借助于距離C4位最近的水分子Wat47，聯(lián)合W393, Q497及Y505, Q497等殘基，共同完成最終的脫質(zhì)子步驟，形成最終的環(huán)化產(chǎn)物。最后，Y307對(duì)D303重質(zhì)子化從而開始下一輪環(huán)化。

中國藥科大學(xué)董廖斌課題組聯(lián)合南京大學(xué)張博副教授和美國佛羅里達(dá)大學(xué)Jeffrey Rudolf助理教授，通過基因組挖掘，發(fā)現(xiàn)隱藏于細(xì)菌基因組中的II型倍半萜合酶，獲得了該環(huán)化酶的晶體結(jié)構(gòu)；在該酶的活性空腔中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的含雙鎂離子的金屬離子簇及與其結(jié)合的谷氨酸殘基。該工作不僅確證了II型萜類環(huán)化酶真實(shí)存在著一個(gè)鎂離子結(jié)合簇，解決了II型萜類環(huán)化酶中的鎂離子結(jié)合簇難題，而且完整描繪出II型萜類環(huán)化酶的催化機(jī)制。此外，鎂離子結(jié)合簇的發(fā)現(xiàn)顯示出自然界選擇進(jìn)化出的萜類環(huán)化酶的精巧催化之美，并體現(xiàn)出I型與II型萜類環(huán)化酶在進(jìn)化過程中針對(duì)催化中心的靈活保留以完成不同的催化使命。

團(tuán)隊(duì)簡介

董廖斌博士，教授、課題組長（PI）、博士生導(dǎo)師。入選“國家海外高層次人才引進(jìn)計(jì)劃”青年項(xiàng)目、“江蘇特聘教授”以及江蘇省“雙創(chuàng)計(jì)劃”。2014年博士畢業(yè)于中國科學(xué)院昆明植物研究所，2014-2019年在美國斯克利普斯研究所從事博士后研究，并于2019年10月引進(jìn)到中國藥科大學(xué)工作。迄今，以通訊及第一作者等在J. Am. Chem. Soc. (5篇), Nature Commun., Science, Nat. Chem. Biol.等期刊發(fā)表47篇論文，申請(qǐng)專利2項(xiàng)，主持國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目等省部級(jí)項(xiàng)目4項(xiàng)。課題組主要從事萜類天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)、生物合成和合成生物學(xué)研究；歡迎有志于從事天然產(chǎn)物生物合成和“化學(xué)-酶”法合成的有機(jī)化學(xué)背景的青年才俊加入課題組。聯(lián)系方式：ldong@cpu.edu.cn.